色譜技術(shù)概述

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引　言
     色譜法是1906年植物學(xué)家Michael Tswett將含有有色的植物葉子色素和溶液通過裝填有白堊粒子吸附劑的柱子，企圖分離它們時而發(fā)現(xiàn)并命名的。各種色素以不同的速率通過柱子，從而彼此分開。分離開的色素形成不同的色帶而易于區(qū)分，由此得名為色譜法（Chromatography），又稱層析法。其后的一個重大進(jìn)展是1941年Martin和Synge 發(fā)現(xiàn)了液－液（分配）色譜法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，簡稱LIC]。 他們用覆蓋于吸附劑表面的并與流動相不混溶的固定液來代替以前僅有的固體吸附劑。試樣組分按照其溶解在兩相之間分配。Martin和Synge因?yàn)檫@一工作而榮獲1952 年諾貝爾化學(xué)獎。在使用柱色譜的早期年代，可靠地鑒定小量的被分離物質(zhì)是困難的，所以研究發(fā)展了紙色譜法（Paper Chromatography，簡稱PC）。在這種“平面的”技術(shù)中，分離主要是通過濾紙上的分配來實(shí)現(xiàn)的。然后由于充分考慮了平面色譜法的優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展了薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，簡稱TLC），在這種方法中，分離系在涂布于玻璃板或某些堅硬材料上的薄層吸附劑上進(jìn)行。
     在Stah－l于1958年進(jìn)行了經(jīng)典性的工作將技術(shù)和所用材料加以標(biāo)準(zhǔn)化之后，
     薄層色譜法方贏得了聲譽(yù)。為了幫助提高紙色譜法或薄層色譜法對離子化合物的分離效率，可以向紙或板施加電場。這種改進(jìn)了方法分別稱作紙上電泳或薄層電泳。
     　　 新近發(fā)展起來的色譜法
    
     氣相色譜法是Martin和James于1952 年先描述的，現(xiàn)已成為所有色譜法中和廣泛使用的一種方法，它別適用于氣體混合物或揮發(fā)性液體和固體，即便對于很復(fù)雜的混合物，其分離時間也僅為幾分鐘左右，這已屬司空見慣。高分辯率、分析迅速和檢測靈敏等幾種優(yōu)點(diǎn)之綜合使氣相色譜法成了幾乎每個化學(xué)實(shí)驗(yàn)室要采用的一種常規(guī)方法。近年來，因?yàn)樾滦鸵合嗌V儀和新型柱填料的發(fā)展以及對色譜理論的更深入了解，又重新引起對密閉柱液相色譜法的興趣。液相色譜法（High-Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）迅速成為與氣相色譜法一樣廣泛使用的方法，對于迅速分離非揮發(fā)性的或熱不穩(wěn)定的試樣來說，液相色譜法常常是更可取的。
     色譜法分類
     色譜法有多種類型，也有多種分類方法。
    
     （一）按兩相所處的狀態(tài)分類
    
     液體作為流動相，稱為“液相色譜”（liquid chromatograp-hy）；用氣體作為流動相，稱為“氣相色譜”（gas
     chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態(tài)，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態(tài)可以分為：
    
     液－固色譜（liquid-solid chromatography）
     液－液色譜（liquid-liquid chromatography）
     氣－固色譜（gas-solid chromatography）
     氣－液色譜（gas-liquid chromatography）
     （二）按層析過程的機(jī)理分類
     吸附層析（adsorption chromatography ）利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。
    
     分配層析（partition chromatography）利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同，而使之分離的方法。
     離子交換層析（ion-exchange chromatography ）利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，而進(jìn)行分離的方法。凝膠層析（gelchromatography）利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進(jìn)行分離的技術(shù)。
    
     （三）按操作形式不同分類
     柱層析（colum chromatography）將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔(dān)體support），點(diǎn)樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析（thin layper chromatography）將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。
     吸附色譜法
     吸附色譜法常叫做液－固色譜法（Liquid-Solid
     Chromatography，簡稱LSC），它是基于在溶質(zhì)和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點(diǎn)之間的相互作用?？梢詫⑽絼┭b填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，例如硅膠、氧化鋁和活性炭等。活性點(diǎn)位例如硅膠的表面硅烷醇，一般與待分離化合物的性官能團(tuán)相互作用。分子的非性部分（例如烴）對分離只有較小影響，所以液－固色譜法十分適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。
     分配色譜法
     在分配色譜法（也稱體液－液色譜法）中，溶質(zhì)分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動相之間按照它們的相對溶解度進(jìn)行分配。固定相均勻地覆蓋于惰性載體─多孔的或非多孔的固體細(xì)?；蚨嗫准埳希埳献V）。為避免兩相的混合，兩種分配液體在性上必須顯著不同。若固定液是性的（例如乙二醇），流動相是非性的（例如乙烷），那么性組分將較強(qiáng)烈的被保留。這是通常的操作方式。另一方面，若固定相是非性的（例如癸烷），流動相是性的（例如水），則性組分易分配于流動相，從而洗脫得較快。后一種方法（它有相反的性）稱作為反相液─液色譜法。由于溶解度差別的細(xì)微效應(yīng)，所以液─液色譜法很適于分離同系物的同分異構(gòu)體。在液─液色譜法中，固定相幾乎都被化學(xué)鍵合在載體物質(zhì)上，而不是機(jī)械覆蓋在它的表面。這種色譜法稱作鍵合相色譜法（Bonded-Phase Chromatography，簡稱 BPC）。這種方法的機(jī)理尚不清楚，可能是分配機(jī)理，也可能是吸附機(jī)理， 視實(shí)驗(yàn)條件而定。液相色譜法中，鍵合相色譜法的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)*其他模式。
     離子交換色譜法
     Sober 和 Peterson于1956年將離子交換基團(tuán)結(jié)合到纖維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發(fā)展。離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上， 還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。
     近年來離子交換色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和化。它們的優(yōu)點(diǎn)是:⑴具有開放性支持骨架，大分子可以自由進(jìn)入和迅速擴(kuò)散，故吸附容量大。⑵具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質(zhì)變性或酶的失活。⑶多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用于分離和制備。
     一、基本理論
    
     離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進(jìn)行時，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，直*。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同理，當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，在被洗脫的能力則決定于各自洗反應(yīng)的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的離子交換過程有兩個階段──吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可以通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而達(dá)到解離但更多的是通過增加離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異 ，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達(dá)到分離化的目的。
     二、離子交換的分類及常見種類
     （一）分類
     離子交換劑分為兩大類，即陽離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強(qiáng)、弱兩種，即 強(qiáng)酸劑　陽離子交換劑
     　弱酸劑　強(qiáng)鹼型　陰離子交換劑　弱鹼型 。
     1.陽離子交換劑
     　　陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。
     某些交換劑在交換時反應(yīng)如下：
     強(qiáng)酸性：R-SO3 -H+ ＋ Na+ R-SO3- Na+H+
     弱酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+
     國產(chǎn)樹脂中強(qiáng)酸1×7（上海樹脂＃732）和國外產(chǎn)品Dowex 50、Zerolit 225等都于強(qiáng)酸型離子交換劑。
     2.陰離子交換劑
     　　陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等鹼性基團(tuán)。某些交換反應(yīng)如下：
     強(qiáng)鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-
     弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-
     強(qiáng)鹼性＃201號國產(chǎn)樹脂和國外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。
     （二）種類
     1.纖維素離子交換劑：陽離子交換劑有羥甲基纖維素（CM-纖維素）， 陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。
     2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應(yīng)，是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離物質(zhì)。常用的Sephadex離子交換劑也有陰離子和陽離子交換劑兩類。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex
     A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽離子交換劑有CM-Sephaetx
     C-50，C-50和Sephadex
     C-25，C-50。陰離子交換劑用英文字頭A，陽離子交換劑的英文字頭是C。英文字后面的數(shù)字表示Sephadex型號。
     3.瓊脂糖離子離交換劑：是將DESE-或CM-基團(tuán)附著在Sepharose CL-6B
     上形成，DEAE-Sephades（陰離子）和CM-Sepharose（陽離子），具有硬度大，
     性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
     三、實(shí)驗(yàn)操作
    
     （一）交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型
     　　新出廠的樹脂是干樹脂，要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績一些雜質(zhì)，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下：新出廠干樹脂用水浸泡2
     小時后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無離子水洗澄清，去水后加4倍量2N HCl攪抖4小時，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N
     NaOH攪抖4小時，除鹼液，
     水洗到中性備用。將樹脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。如希望陽樹脂帶Na+，則用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時以上；如希望樹脂帶H+，可用HCl處理。陰樹脂轉(zhuǎn)型也同樣，若希望帶Cl-則用HCl，希望帶OH-則用NaOH。用過的樹脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉(zhuǎn)型處理就行了。
     （二）柱上操作
     ⑴交換劑裝柱簡單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。
     ⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液
     ⑶洗脫與收集
     　　不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。
     膠色譜法
     　　凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。
     一、基本理論
     （一）分子篩效益
     　　一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動：垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子小的后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有大限和小限。分子直徑比凝膠大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。
     （二）色譜柱的重要參數(shù)
     ⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt
     表示。
     ⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。
     ⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。
     不包括固體支持物的體積（Vg）。
     ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve
     表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰位置所用洗脫液體積為Ve。
     當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。
    
    
    
     二、凝膠的種類及性質(zhì)
     （一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）
     ⑴Sephadex
     G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。
     ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。
     （二）瓊脂糖凝膠：
     　　商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。
     （三）聚丙烯酰胺凝膠：
     　　是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，
     由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P
     （Bio-Gel P），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2P-300共10種，P
     后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。
     （四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，
     可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。
     三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)
     （一）層析柱
     層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，
     直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。
     分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。
     （二）凝膠的選擇 根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex
     G-20的吸水量為20，1 克Sephadex
     G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex
     G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
     （三）凝膠的制備
     商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。別是在使用軟膠時，
     自然膨脹需24小時數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。
     （四）樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex
     G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。
     分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。
     （五）防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:
     ⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40％；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
     ⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的殺菌效果佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。
     ⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01％。在微酸性溶液中為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。
     ⑷苯基汞代鹽
     在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。
     親和色譜法
     一、基本理論
     （一）原理
     　　在生物體內(nèi)，許多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有與某些相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補(bǔ)的DNA等，都具有這種性。生物分子之間這種異的結(jié)合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個進(jìn)行專一結(jié)合的分子互稱對方為配基。如抗原和抗體，抗原可認(rèn)為是抗體的配基，反之抗體也可認(rèn)為是抗原的配基。將一個水溶性配基在不傷害其生物學(xué)功能的情況下與水不溶性載體結(jié)合稱為配基的固相化。親和色譜法的基本過程是：
     1.配基固相化。將與化對象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。
     2.親和吸附。將含有化對象的混合物通過親和柱，化對象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。
     3.解吸附。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲化物質(zhì)洗脫出來。
     （二）應(yīng)用范圍
     親和色譜可用于下列生物體系：
     酶：底物、抑制劑、輔酶
     抗體：抗原、病毒、細(xì)胞
     外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、
     細(xì)胞核酸：互補(bǔ)堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結(jié)合蛋白
     激素及維生素：受體、載體蛋白
     細(xì)胞：細(xì)胞表面異蛋白、外源凝集素
     親和色譜的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、效率高、條件溫和，缺點(diǎn)是使用局限性大。
     （三）載體的選擇原則
     　　
     　　
     用于親和色譜的理想載體應(yīng)具有下列性：⑴不溶性：不溶于水；⑵滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過；⑶有一定硬度，為均一的珠狀；⑷具有大量可供反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，能與大量配基共價連接；⑸非異性吸附能力低；⑹能抗微生物和酶的侵蝕；⑺有較好的化學(xué)穩(wěn)定性；⑻親水性。選擇配基根據(jù)對化大分子的異性的認(rèn)識。
     選擇也的配基有兩條標(biāo)準(zhǔn)：
     *是蛋白質(zhì)和配基之間必須有強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)在5mM以上不是好配基；
     相反親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x蛋白質(zhì)──配基復(fù)合物時所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使蛋白質(zhì)變性。例如用抗生物素蛋白作配基化含生物素的羧化酶時，生物素──抗生物素蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)達(dá)10-15M，解離時需要pH1.5，6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數(shù)已經(jīng)變性。
     選擇配基的第二個標(biāo)準(zhǔn)是，配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與蛋白質(zhì)之間異結(jié)合，但可用于活化和載體相連接，同時又不影響配基與蛋白質(zhì)之間的親和力。
     （四）常見載體的性
     瓊脂糖凝膠： 親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定 （商品名：Sepharose）
     聚丙烯酰胺凝膠： 理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐有機(jī)溶劑及去污劑， 抗微生物能力強(qiáng)， 別適應(yīng)用配基與提取物親和力比較弱的物質(zhì)。
     葡聚糖凝膠： 有良好的化學(xué)及物理性質(zhì)，孔經(jīng)小。
     纖維素： 非易吸附嚴(yán)重，廉價，易得。
     二、實(shí)驗(yàn)方法
     親和色譜分離的方法隨每種分離物質(zhì)的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下：
     1選 擇 配 基；2選擇偶聯(lián)凝膠；3偶 聯(lián) 配 基；4裝填合適的柱；5平衡（2-3倍體積緩沖液）；6應(yīng) 用 樣
     品；7洗滌未結(jié)合物質(zhì)；8洗脫結(jié)合物質(zhì)→除鹽；9再生　
     高壓液相色譜
     　　Martin 和
     Synge在1941年就提出相色譜的設(shè)想，然而直到六十年代后期，由于各種技術(shù)的發(fā)展，液相色譜才付諸實(shí)現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed
     Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用多的名稱是液相色譜（High Pe-rformance Liauid
     Chromatography，HPLC）。液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用，成為一項(xiàng)*的技術(shù)。它的主要優(yōu)點(diǎn)是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復(fù)性高；⑷相色譜柱可反復(fù)使用；⑸自動化操作，分析度高。根據(jù)分離過程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，液相色譜可分為四個基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機(jī)酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽；⑽脂
    
     一、分類
     　　液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
     （一）液－固色譜法
     　　液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強(qiáng)烈相互作用，這些區(qū)域?yàn)榛钚晕恢?，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶距力氫鍵及靜電相互作用。性越強(qiáng)，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中，依靠流動相溶劑分子與溶質(zhì)分子競爭固定相互活性位置，
     從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng)，因而稱強(qiáng)溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的點(diǎn)是適于分離色譜幾何異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。
     （二）鍵合相色譜法
     　　鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
     1.正常相色譜法
     　　在正常相色譜法中共價結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是性基團(tuán)，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是性，因此流動溶劑的性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。
     2.反相色譜法
     　　在反相色譜法中共價結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔?，如正辛基等。流動相的性比固定相的性?qiáng)。反相色譜法在液相色譜法中應(yīng)用廣泛。
     在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非性溶質(zhì)時，溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，
     因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去?？梢姺聪嗌V中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同性基團(tuán)的化合物。可以通過改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，長的是十八烷基，這也是使用得多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水性隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔?，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著性降低而增加。水是性強(qiáng)的溶劑，也是反相色譜中弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
     在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用廣?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治觯虎诘鞍踪|(zhì)的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。
     （三）離子交換色譜
     　　離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，
     這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是－NH2，及－MH3+：陽離子交換劑的功能團(tuán)主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH
     離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
    
     二、易出現(xiàn)的問題
    
     （一）渦流擴(kuò)散（Eddy diffusion）
     　　流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動相的速度就快；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。
     （二）分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）
     　　分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時間長，則擴(kuò)散嚴(yán)重。
     （三）質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）
     　　被分離物質(zhì)要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當(dāng)流速快時，轉(zhuǎn)移速度慢，來不及達(dá)到平衡動相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動，使區(qū)帶變寬。
     （四）動相流速
     　　當(dāng)流速太低時，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到低值時，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大。在液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會降低柱效率。
     （五）固定相顆粒大小
     　　定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。

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